免疫組化代測(cè)，免疫組化試劑盒，免疫組化操作步驟
　

　一 免疫組化（LP 法）操作步驟

　　1． 切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行

　?、?緩沖液洗 3min/2 次。

　?、?為了降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。

　?、?緩沖液洗 5min/2 次。

　　⒌ 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。

　?。ㄗⅲ悍跤灰^(guò) 10 分鐘，否則會(huì)導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）

　?、?緩沖液洗 5min/2 次。

　　⒎ 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時(shí)。（具體孵育時(shí)間和溫度由試驗(yàn)者zui終決定）

　?、?緩沖液洗 5min/2 次。

　　9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增強(qiáng)子），在室溫下孵育 20 分鐘。

　　10 ．緩沖液洗 5min/2 次。

　　11 ．滴加 HRP Polymer（酶標(biāo)二抗） ，在室溫下孵育 30 分鐘。

　?。ㄗⅲ篐RP Polymer 對(duì)光敏感，應(yīng)避免不必要的光暴露并儲(chǔ)存在不透明的小瓶中。）

　　12 ．緩沖液洗 5min/2 次。

　　13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混勻后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時(shí)間由染色深淺決定。）

　　14 ．自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

二．免疫組化主要步驟
1. 洗載玻片:將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時(shí)使一些肉眼看不見(jiàn)的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個(gè)小時(shí)左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中，將多聚賴(lài)氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。
2. 包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，zui后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。
3.切片：將包埋好的組織從模具上取下來(lái)，并置于石蠟切片機(jī)上，切片機(jī)通過(guò)調(diào)節(jié)上下左右來(lái)來(lái)使組織和切割方向一致，然后調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為5µm,如果比較難切，則可以適當(dāng)調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4. 撈組織：當(dāng)組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開(kāi)，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時(shí)，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對(duì)照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時(shí)候方向一致，以便觀察，再將撈出來(lái)的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。
5. 脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個(gè)試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話(huà),就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間,一般為12-15min.
6.抗原修復(fù)：脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來(lái)。
7.血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周?chē)腜BS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來(lái)，然后放入37°C溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
8. 加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周?chē)难?，加一抗，如果做?duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過(guò)一夜。
9. 加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)腜BS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。
10. 加SABC:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)腜BS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11. 加顯色劑：將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)腜BS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）

 A：DAB        B：H2O2        C：磷酸緩沖液
12. 復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
13. 脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min，zui后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。
14. 封片：用中性樹(shù)膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。

三. 免疫組化染色步驟

　　冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過(guò)氧化氫孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。

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