5’-核酸酶(5-NT)檢測(cè)試劑盒(藍(lán)微板法)的操作步驟

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

5’-核昔酸酶(5'-NT 或 NTP)廣泛分布于肝臟、膽道及其他各種組織中，該酶活性變化

常與 ALP 活性相平行。但在骨骼系統(tǒng)的疾病中，如腫瘤骨轉(zhuǎn)移、畸形性骨炎、甲亢、佝僂

病等，ALP 活力增高，但是 5-NT 活力正常，所以對(duì)于 ALP 活力提高的情況，測(cè)定 5-NT

活力有助于判斷 ALP 活力增高原因是肝膽系統(tǒng)疾病還是骨骼系統(tǒng)疾病。

Leagene 5’-核首酸酶(5-NT)檢測(cè)試劑盒(藍(lán)微板法)的檢測(cè)原理為 5-核首酸酶能催

化 5’-磷酸腺昔(AMP)水解，生成腺昔和磷酸，后者與酸反應(yīng)生成藍(lán)，可用比色法測(cè)

定無(wú)機(jī)磷的含量，計(jì)算 5-NT 活性，利用離子能選擇性的抑制 5-NT 的特性，在測(cè)定管

不加人抑制劑鎳離子，測(cè)出的活性為 ALP 和 5-NT 總活性，在對(duì)照管加入離子，可以測(cè)

出 ALP 的活性，測(cè)定管的酶活性減去對(duì)照管的酶活性即獲得 5-NT 活性，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)

680nm 處吸光度。5-核昔酸酶的檢測(cè)對(duì)于研究自由基代謝平衡，抗衰老和腫瘤發(fā)病機(jī)制具

有一定的價(jià)值。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途

自備材料:

1、蒸餾水、生理鹽水

2、離心管或 EP 管

3、離心機(jī)、水浴鍋

4、96 孔板、酶標(biāo)儀

操作步驟(僅供參考) :

1、準(zhǔn)備樣品

①　血漿、血清和尿液樣品:血漿、血清按照常規(guī)方法制備，可以直接用于該試劑盒的測(cè)定，尿液通常也可以直接用于測(cè)定，-20°C凍存，用于 5-NT 的檢測(cè)

②　細(xì)胞或組織樣品:取恰當(dāng)細(xì)胞或組織進(jìn)行裂解，可以采用 RAPI裂解液，如果有必要

需進(jìn)行適當(dāng)勻漿，低速離心取上清，-20°C凍存，用于 5-NT 的檢測(cè)。

③　高活性樣品:如果樣品中含有較高活性的 5-NT，可以使用 AMP 酸性緩沖液稀釋

④　(選做)樣品準(zhǔn)備完畢后可以用 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的 5'-NT 含量

2、配制對(duì)照 NT Assay 工作液 :取適量的 NT Assay Buffer I、II、III,按I : II:III=13 :1:2的比例混合，即為對(duì)照 NT Assay 工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

3、配制測(cè)定 NT Assay 工作液 :取適量的 NT Assay Buffer I、II，按I:II=15 :1的比例混合，即為測(cè)定 NT Assay 工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

4、配制磷標(biāo)準(zhǔn)工作液:取適量的磷標(biāo)準(zhǔn)(6mmol/L)，按磷標(biāo)準(zhǔn)6mmol/L): AMP 酸性緩沖液=1:99 的比例混合，即為磷標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.06mmol/L)，4℃保存1個(gè)月。

5、配制定磷工作液:按定磷酸性液:定磷還原液:鉬酸胺溶液=6:1:1 混勻，即為定磷工作液工作液，4℃保存。

6、NT 測(cè)定:混勻，靜置 5min，蒸餾水調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定 680nm 處吸光度(分別記為 A空

白、A標(biāo)準(zhǔn)、A對(duì)照、 A 測(cè)定)。

注意事項(xiàng)

1、 本試劑盒亦可用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，但檢測(cè)的樣品數(shù)相應(yīng)減少，如果有條件盡量采

用分光光度計(jì)檢測(cè)，使其結(jié)果更為準(zhǔn)確

2、待測(cè)樣品中不能含有 5-NT 抑制劑，同時(shí)需避免反復(fù)凍融

3、用血漿測(cè)定有可能引起渾濁。

4、溶血有輕度影響，脂血癥不會(huì)引起酶活性改變，但可能影響吸光度。

5、與金屬鰲合的抗凝劑會(huì)干擾金屬離子的激活作用，因此不宜采用金屬鰲合抗凝劑

6、離心管或試管必須清潔，否則污染顯色反應(yīng)

有效期:6個(gè)月有效;4℃運(yùn)輸，4℃保存

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