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PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)準(zhǔn)備工作

更新時(shí)間:2018-06-25      瀏覽次數(shù):1587
   PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)準(zhǔn)備工作
  PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)有三步:抽提RNA,RT,PCR。
  試驗(yàn)前注意:
  1.做RT前必需測(cè)RNA濃度,逆轉(zhuǎn)錄體系對(duì)RNA量還是有一些要求,常用500ng或1ug。
  2.RT按要求做,一般不會(huì)出太大問題。
  3.PCR如需擴(kuò)長(zhǎng)片段,則對(duì)前兩步要求較高,需要有完整的cDNA存在,不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。
  實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備:
  1、塑料制品:(包括槍頭、EP管、勻漿管等)先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中,將塑料制品逐個(gè)浸泡其中,其中小槍頭需要吸管打入DEPC水,過夜,然后高壓,再烤干備用,實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái),再高壓一次(EP管)。
  2、玻璃制品:泡酸過夜,沖洗干凈,蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過夜,再烤干)。
  3、勻漿器:(包括剪刀、鑷子)先洗凈后,再高壓(不需要泡DEPC
  試驗(yàn)試劑:
  1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)備用。
  2、75%乙醇:用無水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高壓)。
  3、異丙醇:放入棕色瓶中。
  4、lu仿:放入棕色瓶中。
  5、瓊脂糖
  注意事項(xiàng):
  1、逆轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟是立即冰水浴。
  2、Rt時(shí),先打開PCR預(yù)熱30分鐘。
  3、RNA抽提前,打開離心機(jī)預(yù)冷。
  4、在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。在實(shí)驗(yàn)中,一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活,如煮沸、高壓滅菌等。
  5、做RT前必需測(cè)RNA濃度,逆轉(zhuǎn)錄體系對(duì)RNA量還是有一些要求,常用500ng或1ug。
  6、RT按要求做,一般不會(huì)出太大問題。
  7、PCR,按常規(guī)。但如需擴(kuò)長(zhǎng)片段,則對(duì)前兩步要求較高,需要有完整的cDNA存在,不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。
  8、注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人:lu仿、溴化乙錠(EB)、酚、異硫氰酸胍、紫外線等
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