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MMP2/MMP9明膠酶譜法試劑盒的檢測(cè)原理

更新時(shí)間:2018-05-11      瀏覽次數(shù):3201

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MMP2/MMP9明膠酶譜試劑盒試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法,其靈敏度可達(dá)1 nM,高于ELISA方法,其基本原理1和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮區(qū)域,從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性,檢測(cè)靈敏度~1nM。

試劑盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè),如果小膠加樣孔為10~15個(gè),則總計(jì)可檢測(cè)500~750個(gè)樣品。

MMP2/MMP9明膠酶譜法試劑盒的檢測(cè)原理詳細(xì)操作步驟如下:

1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。

待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液??赏ㄟ^(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。

陽(yáng)性對(duì)照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。

注:因?yàn)槿煞謴?fù)雜,MMP活性較低,好的方法是將全血中白細(xì)胞進(jìn)行分離做陽(yáng)性對(duì)照

?3 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi)??上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37ºC 孵育1~5 小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低,應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過(guò)夜。

6 顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(操作步驟見(jiàn)后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū))。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。

透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

7 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式。

MMP2/MMP9明膠酶譜法試劑盒的檢測(cè)原理

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